Эти процессы систематически начинаются с двухступенчатого согласованного механизма, катализируемого лигазой. Они отличаются от других уже рассмотренных нами процессов того же типа тем, что активированная группа прикреплена к носителю, а не к биосинтетическому строительному блоку. Конечная сборка осуществляется на третьей стадии переносом группы от носителя к биосинтетическому акцептору.
Реакции, зависящие от уд-переноса. Два важных комплекса группы с носителем собираются с помощью АТФ-образующих лигаз по общей схеме уа-двухступенчатого последовательного переноса групп. Один из них — карбоксибиотин, имеющий сходную с карбаматом структуру, и связанный с ферментом карбоксилфосфат; он выступает в роли посредника и является донором активированных карбоксильных групп в ряде реакций карбоксилирования, как показано на схеме.
Биотин, или витамин Н, который играет каталитическую роль во всем трехступенчатом процессе, принадлежит к молекулам, представляющим исторический интерес. В названии этого вещества нашло свое отражение раннее открытие в области пищеварения, касающееся фактора роста дрожжей, которое принадлежит бельгийскому биохимику Эжену Вильдьерсу. Ис-следователь был так поражен жизненной силой найденного им фактора, что назвал его «биос». Позднее производное от этого названия нашло. отражение в названии одного из витаминов в память выдающегося открытия. При выполнении функций переносчика биотин ковалентно связывается с гибкой полипептидной «рукояткой», входящей в мультиферментный комплекс, который содержит лигазу и карбоксилазу. Его транспортная функция ограничена челночным движением карбоксильных групп между активными центрами двух ферментов.
Похожий трехступенчатый механизм, но с участием формилфосфата, связанного с ферментом, выступающим в роли посредника, служит для прикрепления форматов (солей муравьиной кислоты) (Н—СО—О"") к носителю, тетрагидрофолату (ТГФ) ->- производному витамина фолиевая кислота (лат. {оИит—лист), который является одним из скрытых ингредиентов шпината, известного своими противоанемическими свойствами. ТГФ не только несет активированную формильную группу к различным формилтрансферазам, но нередко «предлагает» ее некоторым модифицирующим фер-ментам, способным переводить ее в метениловую (—СН=), метиленовую (—СН2—), гидроксиметиленовую (—СНгОН), метиль - ную (—СНз) или формиминовую (—СН=ЫН) группы. Каждая группа принимает участие в ряде реакций переноса. Таким образом, мы имеем дело с весьма «многосторонним» коферментом, который действует одновременно и как носитель, и как «рукоятка» для активированных групп. Среди многих веществ, образование которых зависит от ТГФ, назовем аминокислоту метионин (см. с. 162—163), пури - новые основания и пиримидиновое основание тимин, один из компонентов ДНК Реакции, зависящие от рр-переноса. С помощью этого механизма происходят два главных биологических процесса. В обоих карбоновая кислота (К—СО—О-) является строительным блоком, а АТФ используется в качестве энергетического донора; оба зависят от АМФ-образующей лигазы для создания стабильного, растворимого ацилнесущего комплекса при помощи связанного с ферментами ацил-АМФ - посредника:
Одним из таких процессов является синтез белка, в котором аминокислоты являются X—О - строительными блоками, а соотвзтствующие транспортные РНК (тРНК) — носителями. Отметим, что полипептидные цепи растут с «головы» (см. с. 154—155). Это означает, что между промежуточной и конечной стадиями сборки в приведенной схеме имеется дополнительная стадия, на которой комплекс носитель —СО—К (аминоацил-тРНК) выполняет роль акцептора растущей цепи.
В другом процессе, также происходящем с помощью трехступенчатого ^-механизма, используется набор органических кислот, среди которых имеются жирные кислоты, обнаруживаемые в липидах в качестве строительных блоков X—0~, и кофермент А, выступающий в роли носителя. Своим названием последний обязан тому, что впервые его обнаружили как кофактор в реакциях ацетилирования. Он является производным витамина Р, или пантотеновой кислоты, — повсеместно распространенного вещества (греч. рап1о1Неп — всюду); в свое время оно получило весьма сомнительную известность как восстановитель волосяного покрова: нехватка витамина вызывает преждевременное поседение у крыс.
Кофермент А — сложная молекула, со-держащая, помимо пантотеновой кислоты, несколько других составляющих, в том числе молекулу АМФ. Это вещество имеет в своем составе тиольную группу (—5Н) в качестве реактивного конца и сокращенно обозначается КоА—5Н. Производными ацил-КоА являются тиоэфиры, которые, как мы уже отмечали, представляют собой высокоэнергетические соединения с «физиологическими» групповыми потенциалами порядка —14 ккал/г-моль. Тем * не менее их образование высокоэкзергонично, так как требует 28 ккал/г-моль.
Основными акцепторами V—Н-ациль - ных групп, представляемых коферментом А, являются спирты:
Получаемые в результате реакции эфиры — низкоэнергетические соединения, которые осуществляют заключительный перенос и делают его практически необратимым процессом. Среди молекул, образующихся таким образом, имеются нейромедиатор ацетилхолин (уксусная кислота плюс холин), различные эфиры жирных кислот и глицерин, обнаруживаемые в нейтральных липидах и фосфолипидах, а также ряд других веществ. Кофермент А участвует в ряде других важнейших реакций как медиатор активированных ацильных групп, метаболическая «рукоятка» и участник некоторых окфос-блоков субстратного уровня. (Вспомните роль тиоэфирных связей в работе таких блоков, о которых шла речь на с. 151 —153.) Это ключевой участок клеточного механизма.

Белки, нуклеиновые кислоты, нейтральные липиды, фосфолипиды, полисахариды, стероиды, терпеноиды, нуклеотиды, коферменты, аминокислоты, пурины, пиримидины — этот далеко не полный список веществ, которые встретились нам за время короткой экскурсии, выглядит как справочник по современной биохимии «Кто есть кто». Уже сейчас ясно, что наша простая схема позволила ответить на многие вопросы. Но ничего удивительного, что на все вопросы ответить не удалось. Об отдельных исключениях из правил следует упомянуть.
Во-первых, некоторые реакции переноса не зависят от прямой нуклеофильной атаки. Среди них назовем трансаминирование и транстиолирование, в ходе которых в действительности происходит обмен групп. Кроме того, встречаются случаи, и таких немало, когда образующаяся связь имеет более высокую свободную энергию гидролиза, чем связь НТФ, используемая в процессе биосинтеза. Интересно, откуда же идет снабжение энергией, вернее, как она высвобождается? Как и следовало ожидать, почти всегда ее источником служит гидролиз АТФ. Что же касается средств, то их можно классифицировать как «повышение энергии донора» или «понижение энергии акцептора».
Примером первого случая служит процесс сульфурилирования — реакций, в ходе которых эфирные сульфогруппы сульфомукополисахаридов и сульфолипидов образуются из неорганического сульфата. Реакция начинается типичной рр-атакой сульфата на АТФ; в результате образуется двуглавый аденилилсульфат, который высвобождается в легко растворимой форме. Однако «физиологическая» свободная энергия гидролиза этого ангидрида настолько высока (особенно при очень низких концентрациях неорганического сульфата, преобладающих в большинстве живых клеток), что даже полный комплект из 28 ккал/г-моль, образующийся в результате разрыва р-связи АТФ, недостаточен, чтобы повысить концентрацию этого ангидрида до уровня, необходимого для его распространения и достижения отдаленных участков сборки. Поэтому он не может служить донором сульфогрупп (реакция указана пунктирными стрелками на схеме). Природа эту проблему решила путем фосфорилирования З'-гидроксильной группы аденилилсульфата — высокоэкзергони - ческой реакции, способной повысить концентрацию ее фосфорилированного про-дукта как минимум на четыре порядка по сравнению с субстратом. Образующийся З'-фосфоаденилилсульфат способен выполнять роль транспортной модели и в ряде реакций сборки действует как донор сульфогрупп. После того как он выполнит свои обязанности, 3-фосфатная группа АМФ расщепляется. Полностью процесс выглядит следующим образом:
2АТФ + ЗОГ + V" >
-»• У—ЗОз" + АМФ АДФ + ФФн (2 Фн) + Фн.
Расход энергии составляет 42 ккал/г - моль.
Примеры акцепторного активирования можно наблюдать при синтезе жирных кислот, например в порфириновом кольце, а также в ряде реакций аминирования. В каждом случае акцептор в конечной сборочной реакции соединяется с карбоксильной (—СО—О-) или ацильной (—СО—Р—) группой, которая отделяется после сборки. Тем самым свободная энергия декарбоксилирования или дезацилирования добавляется к потенциалу отдаваемой группы для поддержания стоимости образования новой связи, как показано на приводимой ниже схеме.При синтезе жирных кислот донором является растущая ацильная цепь, а в роли носителя выступает белок-носитель (ацилпереносящий белок, АПБ), активная группа которого состоит из части молекулы кофермента А - Акцептор — малонил-АПБ, производное малонил-КоА, который активирован ацетил-КоА в реакции карбоксилирования (с помощью биотин-зависимого Уа-механизма, наподобие описанного на с. 157), как показано на схеме внизу.
Заметим, что конечным продуктом реакции сборки (р-кетоацил-АПБ на два углеродных атома длиннее, чем донор ацил - АПБ) выступает вещество, которое было бы получено при прямом переносе ацильной группы на ацетил-АПБ. Однако обычно такой реакции не происходит, так как потенциал переносимой ацильной группы в р-кетоацильном продукте намного выше, чем у тиоэфирного донора. Эта реакция происходит в живых клетках (с кофер - ментом А в качестве носителя), но в обратном направлении (тиолиз 0-кетоацил - КоА производного при посредничестве кофермента А), как часть процесса деградации жирных кислот. Путем карбоксилирования акцептора ацетил-АПБ за счет дополнительных 14 ккал/моль клетка снабжается дополнительной энергией, равной 6—8 ккал/г-моль. Этого достаточно для сдвига реакции в направлении сборки. Реакция заключается в наращивании цепочки к двууглеродному строительному блоку. После сокращения цепочки на две Р-кетогруппы процесс повторяется, чередуясь со стадиями редукции до тех пор, пока не будет построена вся цепочка Перед нами еще один пример роста цепочки с «головы» (с. 154—155).
Аналогичная стадия имеется И при построении порфиринового кольца, идуще го на формирование таких важных молекул, как гемоглобин, цитохромы (гл. 9) и хлорофиллы (гл. 10). В этом случае до-нором является сукцинил-КоА, акцептором — аминокислота глицин, которая в данной реакции ведет себя как метиламин (СНз—активированный в результате карбоксилирования (см. верхнюю схему на с. 163). В результате вырабатывается б-аминолевулиновая кислота — предшественник порфиринового кольца.
В реакциях аминирования, которые, за редким исключением, представляют собой невыгодные в термодинамическом плане реакции из-за низкой концентрации аммиака в клетках, последний заменяется в качестве акцептора глутамином (амидом глутаминовой кислоты), который образуется в результате типичного уd-двухступенчатого процесса, как мы видели раньше. В этих реакциях аминирования глутамин обладает свойствами молекулы аммиака,активированнои в результате ацилирования с глутаминовой кислотой (см. схему на с. 163).
В некоторых реакциях аминирования активированной формой аммиака является аспарагиновая кислота. Механизм реакций отличается от рассмотренного нами.
В заключение нашего короткого путешествия по биосинтетическим причудам клетки познакомимся с важнейшим представителем крайне редких процессов, зависящих от ар-атаки на АТФ (трансаденозилирование). Атакующим агентом здесь выступает метионин — аминокислота, ха-рактеризующаяся наличием тиометильной группы (—5—СНз). В данном случае атака осуществляется атомом серы, а не атомом кислорода. Кроме того, последующие реакции сборки включают в себя перенос не целой активированной молекулы, а толь-ко ее концевой метильной группы, которая оказывается легко переносимой из-за поло-жительного заряда, приобретенного атомом серы при аденозилировании. Неорганический трифосфат — другой продукт ар-атаки — образуется не сам по себе, а в результате гидролиза до неорганического фосфата и пирофосфата; последний затем расщепляется под влиянием пирофосфата - зы (см. схему на с. 163, внизу).
Этот процесс ответствен за многие важные реакции метилирования, в том числе и за относящиеся к нуклеиновым кислотам, что, как вы заметите, весьма дорого обходится клетке: почти 35 ккал/г-моль. Процесс начинается не с крахмала и метанола (СНзОН) в качестве строительного блока; источником метильной группы служит метионин. Последний восстанавливается из гомоцистеина; при этом донором метила является метилтетрагидрофолат (см. с. 157—158):

В этих реакциях некоторая часть НТФ переносится к конечному биосинтетическому акцептору. Переносимая группа берется от предшественника, обычно от Фн или НМФ; на нашей сводной двухступенчатой диаграмме он обозначен как строительный блок X—О-, предварительно активированный или включенный в НТФ с помощью центрального восстановительного механизма. Жертвуемая молекула НТФ обладает свойствами посредника —двуликого Януса.
Реакции, зависящие от переноса уа. НТФ, вовлеченный в эти реакции, почти всегда представлен молекулой АТФ и действует как НДФ-носитель, переносящий фосфорильную группу.Большая часть фосфора, содержащегося в природных веществах (это разнообразные группы, которые включают нуклеозидфосфаты, несколько коферментов, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и многочисленные метаболиты),, первым вступает в комбинации по такому типу реакции. Исключение составляют концевая фосфорильная группа самой молекулы АТФ, которая включается благодаря действию окфос-блока, и те случаи, когда неорганический фосфат атакует предсуществую - щую связь (фосфоролиз).
«Стоимость» биосинтетического преоб-разования уже установлена:
АОбиосинт — 14 ДОгндр (V —ф) .
Обычные фосфатные эфиры, в том числе и НМФ, имеют «физиологические» групповые потенциалы от —6 до —8 ккал/г-моль. Таким образом, потеря свободной энергии, связанная с их образованием, колеблется между 8 и 6 ккал/г-моль, что делает реакцию практически необратимой. Однако ряд других фосфатных компонентов имеют «физиологические» групповые потенциалы около —14 ккал/г-моль, что делает транс - фосфорилирование с участием АТФ легко обратимым (ДО ~ 0). Среди них — все НТФ и НДФ, которые, как мы уже видели, могут свободно подвергаться трансфосфорилированию с участием АТФ. Благодаря этим реакциям любые НМФ или НДФ, которые образуются, немедленно реактивируются в НТФ и готовы к участию в новом биосинтетическом процессе (см. выше). И напротив, в случае острой потребности АТФ, например в начале работы мышц, клетки могут обратиться за помощью к собственным молекулам НТФ и НДФ (в том числе, и к АТФ) для восстановления затраченных молекул АТФ путем обратимых реакций трансфосфорилирования. Но главная ответственность падает на другую группу высокоэнергетических соединений, называемых фосфогенами, для которых характерно наличие амидофосфатной связи. Фосфогеном позвоночных служит креатинфосфат, образующийся из креатина по уа типу реакций переноса фосфорильной группы от АТФ:
АТФ + Креатин « АДФ + Креатин ~ Ф.
Равновесие этой реакции благоприятствует образованию АТФ. Только при достаточно высоком соотношении концентраций АТФ и АДФ, что, например.наблюдается в клетках, не подверженных энергетическому стрессу, происходит сдвиг реакции слева направо: запас креатин - фосфата восстанавливается. Как только начинается потребление АТФ и уровень АДФ поднимается, направление реакции изменяется справа налево и креатинфосфат служит для восстановления АТФ из АДФ. Это позволяет клетке продержаться до того времени, пока окфос-блок' не заработает в полную силу.
Ферменты, катализирующие уа-реакции трансфосфорилирования из АТФ, называются фосфокиназами или просто киназами . Помимо участия во многих биосинтетических процессах и в кругообороте энергии фосфокиназы также выполняют важную роль в качестве инициаторов катаболических реакций. Именно в этих реакциях установили их существование, после чего было обнаружено, что перед поступлением в гликолизную цепь глюкоза должна быть активирована «гексокиназой» (см. гл. 7).
Имеется также особая группа фосфокиназ, действующих на белки. Они управляют рядом регуляторных процессов, включая ответственные за деление клеток, и поэтому могут быть вовлечены в процесс беспорядочного размножения раковых клеток.
Реакции, зависящие от Ра-переноса. НТФ, принимающий участие в этом редком типе реакций, выступает как НМФ-носитель, несущий пирофосфорильную группу (предварительно отделенную от Фн и активированную с помощью центрального восстановительного механизма):К числу важнейших акцепторов фос - форильной группы относится тиамин, или витамин В1 — первый среди всех обнаруженных витаминов. Тиаминпирофосфат (ТПФ) является очень важным коферментом в реакциях декарбоксилирования. Чтобы отделить от Фн пирофосфорильную группу, требуется 28 ккал. Часть этой энергии запасается в ТПФ и высвобождается только после гидролиза группы ФФ. Однако между свободной энергией гидролиза пирофосфатной связи, связывающей ФФ с АМФ в АТФ, и энергией присоединения эфира к тиамину в ТПФ имеется существенная разница. Она составляет от —8 до —10 ккал/г-моль. Этого вполне достаточно, чтобы сделать транспирофосфорилирование полностью необратимым.
Реакции, зависящие от рр-переноса. НТФ здесь представлен активированной группой НМФ, связанной с пирофосфат - ным носителем, как показано в верхней части приводимой ниже схемы. Энергетический вклад пирофосфатазы делается на начальной стадии реакции переноса, поэтому для формирования связи НМФ—У имеется около 28 ккал/г-моль.
Большинство процессов, при которых происходит включение нуклеотидильных групп в стабильные продукты биосинтеза, протекают по типу рр транснуклеотидилирования. К ним относятся фундаментальные процессы образования РНК и ДНК, а также реакции, протекающие в процессе синтеза НАД и других коферментов, таких, как НАДФ, ФАД, и кофермента А (см. с. 158—159); все они также содержат АМФ. Аденилирование играет важную роль в регуляции некоторых ферментных белков.
В отдельных самоатакующих вариациях реакций Рр-переноса атакующим веществом является внутренняя З'-гидроксильная группа самой переносимой нуклеотидильной группы. Важнейшая реакция такого рода, катализируемая аденилатциклазой, приводит к образованию 3' 5'-циклического АМФ (цАМФ), важного внутриклеточного медиатора действия гормонов:Реакции этого класса подчиняются основным правилам последовательного переноса групп. Они либо катализируются одним ферментом лигазного типа и затем проходят путь посредника Януса, связанного с ферментом, либо переносятся с по-мощью двул различных ферментов, нередко физически отделенных друг от друга. Янус переносит группу X с места активации к месту сборки вместе с группой от активированного НТФ, выступающей в качестве носителя в комбинации с атомом кислорода, отобранным от строительного блока X—V-.
Реакции, зависящие от уд-переноса Они протекают с участием НТФ в качестве носителя группы X в составе посредни ка Януса:
В ряде таких реакций строительный блок X—О" представлен карбоновой кислотой и в роли двуликого посредника выступает соответствующий ацилфосфат:
Такие соединения обычно нестабильны. Кроме того, подобно многим ангидридам — веществам, образующимся при дегидрата - ционном конденсировании двух кислот, — они являются высокоэнергетическими, с групповыми потенциалами, имеющими величину, сравнимую с величиной потенциала у-связи пирофосфата (ангидрид фосфорной кислоты) в молекулах НТФ. Это препятствие можно устранить с помощью ферментов типа лигаз. В таких случаях АТФ выступает в роли стандартного поставщика энергии, а лигазы являются АДФ-образующими (не путать с АМФ-образующими лигазами, которые нам встретятся при рассмотрении реакций, снабжаемых энергией р-связи).
Конечными акцепторами активированной ацильной группы часто выступают аммиак (МН3) или первичные аминогруппы (К—Г^Ня). Образующаяся при этом амидная связь (—СО—ЫН—) имеет сравнительно низкую «физиологическую» свободную энергию гидролиза, от —6 до —8 ккал/г-моль. Таким образом, процесс в целом является достаточно экзергони - ческим, а потому и необратимым. Синтез аспарагина из аспарагиновои кислоты, а глутамина — из глутаминовой кислоты (см. гл. 2) и трипептида глутатиона из глутаминовой кислоты, цистеина и глицина — все это примеры двухступенчатого согласованного механизма, использующего энергию уа-связи. То же можно сказать и о синтезе производных карбамоила (К—СО—ЫНг), к которым относятся промежуточные продукты, образующиеся при синтезе аминокислоты аргинина, а также мочевины и пиримидиновых оснований. Но эта реакция представляет для нас интерес своей особенностью: активация и сборка катализируются двумя различными ферментами, связанными со свободно циркулирующим посредником Янусом, карба - моилфосфатом. Термодинамическая сложность, возникающая на пути такого механизма, преодолевается в ходе согласованного процесса, посредством которого карбамат — субстрат на стадии активации — образуется в виде связанного с ферментоу продукта конденсации бикарбоната с аммиаком. Этот процесс также катализируется посредством двухступенчатого уа-механизма. Таким образом, перед нами цепь двух последовательных уа-двухступенчатых механизмов. Первые три реакции катализируются одним трифункциональным фер-ментом — карбамоилфосфатсинтетазой, при участии двух нестабильных связанных ферментом посредников (они указаны внутри скобок в последовательности реакций в верхней части схемы): карбоксилфосфа - та, продукта Януса, получаемого в результате первой активации, и карбамата, продукта первой стадии сборки, который затем становится субстратом при вторичной активации. Вторая стадия сборки (пунктирные стрелки) катализируется отдельным ферментом.
На образование низкоэнергетической амидной связи карбамата и высокоэнергетической связи его ангидрида с фосфорной кислотой затрачиваются две у-связи, или 28 ккал/г-моль, что в сумме составляет 20—22 ккал/г-моль. Весь процесс в сильной степени экзергонический благодаря запасам энергии в связанном с ферментами карбамате. То же относится и к последующему переносу карбамоильной группы, к ее биосинтетическому акцептору, в результате которого она переводится с высокого уровня группового потенциала на низкий.
Иногда конечный продукт двухступенчатой уа-реакции, X—V, сам по себе является высокоэнергетическим соединением, например тиоэфир (характеризующийся связью —СО—5). В этом случае процесс легко обратим и может также способствовать образованию НТФ из соответствую-щего НДФ и Фн за счет расщепления связи X—У:
Реакции такого типа играют важную УДФ — О — роль в действии некоторых окфос-блоков на субстратном уровне, в которых тиоэфир - ная связь образуется за счет окислительного конденсирования Р1—5Н-тиола с аль - ™ дегидом (К—СН=0):
Добавив эти две реакции, получим полную картину окисления альдегида до соответствующей кислоты с сопряженным образованием НТФ. Этот процесс протекает в окфос-блоке гликолитической цепи (гл. 7):
В другом окфос-блоке на субстратном уровне окисляемым субстратом является а-кетокислота, которая в подобной окислительной комбинации с тиолом образует тиоэфир и побочный продукт декарбокси - лирования:
В этих реакциях К1—ЗН-тиол играет каталитическую роль в процессе сопряжения. Тиоэфир является промежуточным продуктом очень редкого типа. Он способен выполнять функции преобразователя электронсвязанной энергии и энергии, связанной с группами, и может образовываться за счет той или другой энергии
Реакции, зависящие от псевдо-ур-переноса. При синтезе гликогена, разветвленного древовидного полимера, состоящего из тысяч молекул глюкозы (см. гл. 2 и 7), активированные гликозильные единицы переносятся на концы растущих ветвей («рост с хвоста», см. с. 155) с УДФ в качестве носителя:
Этот пример может служить образцом синтеза углеводов, независимо от того, являются ли они дисахаридами, олигоса - харидными боковыми цепочками глико - протеинов и гликолипидов или полисахаридами. Всякий раз активированные молекулы Сахаров передаются акцептору с помощью НДФ, который, в зависимости от природы сахара, может быть представлен УДФ, АДФ, ГДФ или ЦДФ. Перенос осуществляется непосредственно до конечного биосинтетического акцептора, как при синтезе гликогена, или с помощью жиро-растворимого носителя долихилмоно - или дифосфата, как при некоторых реакциях гликозилирования, которые происходят в эндоплазматическом ретикулуме (гл. 6). НДФ-носители действуют как «рукоятки». Например, молекула глюкозы претерпевает ряд метаболических трансформаций в процессе прикрепления к УДФ.
Любопытно, что структура НДФ-саха - ров полностью соответствует структуре, которую можно ожидать для посредников, образующихся при ур-переносе (перенос НДФ) на свободную молекулу сахара:
НТФ + Сахар *- НДФ—Сахар + Фн.
Однако природа пошла не по этому
пути. На самом деле НДФ-сахара образуются за счет рр-переноса с участием гликозилфосфата в качестве акцептора. Сам гликозилфосфат образуется непосредственно или косвенно в результате у<)- трансфосфорилирования из атф, как показано в приводимой выше схеме.
Обратите внимание на двойственный характер двуликого посредника Януса. В начальной стадии своего образования он имеет два лица — НМФ-ное и гликозил - фосфорильное. При реакциях сборки с ним происходит метаморфоза и он превращается в молекулу с НДФ-иловым и гликозиловым ликами. Из-за гидролиза ФФн каждая гликозильная часть (6—8 ккал/г-моль) «стоит» двух у-связей или 28 ккал/г-моль, что вдвое дороже по сравнению со стоимостью простого двухступенчатого ур-механизма. Почему природа не воспользовалась последним путем, остается только гадать. Быть может, не представлялось такой возможности, а быть может, такой путь имеет недостатки, которые мы не замечаем.
Реакции, зависящие от Bd-переноса. В этих очень редких реакциях пирофосфат является носителем групп X в посреднике Янусе, как показано на схеме.Общее количество энергии, расходуемой на синтез X—V, 28 ккал/г-моль. Однако большая ее часть может оставаться в двуликом промежуточном продукте, поскольку это стадия сборки, которая выигрывает от низких концентраций ФФн, образующихся в результате действия пиро - фосфатазы. Эти процессы отличаются от Рр-механизма (см. ниже).
Важнейший X—О - строительный блок Ра двухступенчатых реакций — 5-фосфорибоза, молекула, остающаяся при гидролизе пуринового или пиримидинового оснований и мононуклеотида. Перестройка некоторых мононуклеотидов может происходить согласно типичному Ра-двухступенчатому механизму с участием фосфорибозилпиро - фосфата (ФРПФ) в качестве посредника Януса. Например, гуанин может объеди-ниться с 5-фосфорибозой и образовать ГМФ, как показано выше.
Такое «спасение» оснований — только одна из функций ФРПФ. Кроме того, он является промежуточным продуктом при синтезе аминокислот гистидина и триптофана, а также тех, которые имеют пури - новое кольцо.
Другим ключевым промежуточным продуктом, имеющим структуру X—О—ФФ, является изопентенилпирофосфат — предшественник важных жирорастворимых молекул, в том числе хиноновых электронных переносчиков (см. гл. 9 и 10), а также витаминов А, Э, Е и К, стеролов и стероидов, каротиноидов, терпеноидов, латекса (резины), эфирных масел и многих других веществ из группы изопреновых:
Это важное вещество образуется не в результате Ра-пирофосфатного переноса, а путем сложного механизма, включающего два уа-фосфорильных переноса. Иными словами, здесь мы сталкиваемся с псевдо - в-механизмом. В совокупности с подлинным механизмом он оказывает дополнительную энергетическую поддержку на стадии сборки благодаря действию пирофосфатазы и заслуживает того, чтобы мы его здесь рассмотрели.
Как правило, две или больше 5-угле - родных единиц объединяются вместе с высбождением неорганического пирофосфата; этот процесс происходит при помощи повторяющегося механизма переноса, при котором конечный атом углерода изопен - тилпирофосфата является акцептором, а растущая цепь — переносимой группой (см. приводимую ниже схему реакций). Перед нами типичный пример «роста с головы» удлиняющейся цепочки. Синтез жирных кислот (см. с. 161) и белка происходит по-другому. Характерная черта данных механизмов заключается в том, что «двуглавый» продукт реакции активации сначала выступает в роли акцептора части цепочки, которая уже почти закончила свой рост, а затем выполняет функции группового донора. Если же рост происходит с хвоста, «двуглавый» промежуточный продукт сразу же отдает группу растущей цепочке.Этот процесс наблюдали при синтезе полисахаридов.Здесь мы рассматриваем, вероятно, наиболее широко распространенный биосинтетический механизм.Он происходит согласно следующей схеме с участием НМФ—О—X в качестве промежуточного продукта:Преимущество этого механизма заключается в том, что он полностью обладает силой р-связи (до 28 ккал/г-моль), т. е. энергией, необходимой для активации. Получающиеся в результате промежуточные вещества часто представляют собой нестабильные молекулярные соединения, которые остаются связанными с ферментами. Активация и сборка катализируются в отработанной последовательности с помощью единственного фермента. Эти лигазы используют АТФ в качестве энергетического донора, как это делают АДФ - образующие лигазы, которые катализируют подобные согласованные реакции, снабжаемые энергией от у-связи (см. с. 150). К важным ферментам этой группы принадлежит ДНК-лигаза — один из основных агентов, участвующих в синтезе ДНК - Ряд других биосинтетических процессов осуществляется с помощью АМФ-образую - щих лигаз.
Для некоторых двухступенчатых процессов, зависящих от рр-переноса, требуется участие двух отдельных ферментов, связанных стабильным промежуточным продуктом, в котором активированная группа X переносится НМФ-ностелем. Напомним, что таким образом образуются НДФ-сахара, хотя при сборке они ведут себя несколько иначе. Более ортодоксальные промежуточные, продукты этого же класса образуются при рр-переносе между ЦТФ и различными фосфорилированными строительными блоками, используемыми при синтезе фосфолипидов, в том числе фосфатидных кислот, фосфорилхолина, фосфорилэтаноламина. Эти соединения имеют структуру ЦДФ—К и таким образом обозначаются (например, ЦДФ-холин). Однако в отличие от НДФ-сахаров они не выступают в роли К-доноров при последующей сборке, а продолжают вести себя как промежуточные продукты, внешне выглядящие как ЦМФ и К-фосфорил, как показано на схеме.

Митохондрии растут и делятся так, как этого следует ожидать от симбиотических микроорганизмов. Однако в отличие от их предполагаемых бактериальных предшественников они вряд ли производят хотя бы один из своих компонентов. Большинство митохондриальных белков синтезируется в экстрамитохондриальной цитоплазме согласно приказам, посылаемым из ядра. Но, каким образом белки направляются в митохондрии и проходят через два слоя мембраны митохондрий, еще далеко не ясно.
С определенностью можно сказать, что это происходит не так, как у бактерий. Бактерии сами производят белки с помощью своих рибосом, считывая информацию с генов. Казалось бы, симбиотические потомки должны были последовать примеру своих далеких предков. Поскольку это не так, значит, мы должны отвергнуть симбиотическую теорию происхождения митохондрий. Но не обязательно, так как митохондрии не полностью контролируются генами ядра. У них имеется собственная генетическая система, очень примитивная и рудиментарная, кодирующая только небольшое количество белков. Но все же она цельная, законченная, содержит ДНК, а также все другие структуры, необходимые для репликации, транскрипции и трансляции генетической информации. Эта система функционирует, что проявляется в синтезе некоторых специфических митохондриальных белков, например части комплекса цитохромоксидазы. Она даже может подвергаться мутациям, которые поэтому передаются цитоплазмой, а не ядром, согласно обычному менделевскому хромосомному механизму. Типичный пример наследственных изменений, затрагивающих митохондриальную ДНК, — так называемая «реtitе» мутация дрожжей.
Удивительно другое: система митохондриального генетического аппарата имеет типичные черты бактерий. ДНК кольцевая, напоминающая бактериальную ДНК. Рибосомы меньше цитоплазматических и почти таких же размеров, как бактериальные. Их способность синтезировать белки блокируется антибиотиком хлорамфениколом, ингибитором синтеза белка бактерий, но не синтеза белка эукариотов; на синтез белка не влияет циклогексимид — ингибитор белкового синтеза эукариотов, который также неактивен у бактерий. И, что самое поразительное, митохондрии даже не «разговаривают» на языке, свойственном всей остальной клетке; у них несколько иной генетический код.
Таковы несколько причин, в силу которых многие ученые верят в происхождение митохондрий от каких-то далеких прокариотических предков, которые были «усыновлены» эндосимбиотическим путем. В процессе длительной интеграции они постепенно утеряли контроль над собственной судьбой, но все же умудрились сохранить определенные признаки своей ранее существовавшей автономии, которые пронесли без изменения в ходе длительного, изнуряющего процесса эволюции. Они в какой-то степени проливают свет на исторические события необычайной важности,которые происходили более миллиарда лет назад. События эти могли бы навсегда остаться погребенными во мраке прошлого, если бы не митохондрии-«сплетники». Однако взгляды на раскрытие тайн расходятся, и эти явления интерпретируются разными учеными по-разному.

Митохондриальные энергетические преобразователи располагаются исключительно внутри розового, складчатого «футляра», который образует внутреннюю мембрану телец. Это очень тонкая оболочка толщиной 7 при нашем увеличении в миллион раз она составит чуть больше 60 мм. Снаружи она гладкая, а изнутри покрыта мелкими узелками. Узелки имеют в диаметре около 9 им (что составляет примерно 80 мм при увеличении в миллион раз) и прикрепляются к мембране короткими, узкими стволиками, отчего внутренняя сторона мембраны похожа на поверхность, покрытую крошечными грибами.Для дальнейшего исследования нам потребуется наше молекулярное увеличительное стекло. Вид, который открывается с его помощью, поистине удивителен; это один из величайших шедевров молекулярной инженерии. Вся поверхность мембраны покрыта микросферами; каждая из них состоит из 15—20 различных видов электронных носителей, объединенных для обеспечения необходимого электронного переноса. В одном-единственном теле митохондрий может существовать почти 100 000 таких микросфер.
Эти микросферы, обычно называемые дыхательными цепочками, включают набор различных молекул. Наиболее известные среди них — флавины и гемы. Флавины — удивительный класс зеленовато-желтых пигментов, образованных из рибофлавина, или витамина Вг. Наиболее важными флавиновыми производными являются флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Их основное свойство заключается в способности выступать в роли носителей водорода. Таким образом, они служат коферментами для многочисленных фла - виновых дегидрогеназ.
Гемы близкие родственники хлорофиллов, зеленых фотосинтетических пигментов, с которыми их роднит одно характерное свойство: наличие порфиринового ядра — плоской, дискообразной молекулы, состоящей из четырех пиррольных колец, связанных метеновыми (—СН=) мостиками. В центре диска имеется отверстие, окруженное электронами четырех резонирующих атомов азота. Если мы поместим в отверстие ион магния, то получим молекулу хлорофилла. При замене иона магния на ион железа получится гем Благодаря свойству железа принимать форму двухвалентного (Ре2+) или трехвалентного (Ре3+) иона гем представляет собой электронный носитель:
Гем—Ре2+ ^ Гем—Ре3+ + е~.
В комбинации с белками гемы образуют целый набор «доспехов», состоящий из разноцветных молекул с оттенками от кроваво-красного до горохово-зеленого. Все они в той или иной степени участвуют в утилизации кислорода. Наиболее известная функция заключается в доставке кислоро-да, который переносится красным кровяным пигментом — гемоглобином. В дыхательной цепочке гемопротеиды представлены рядом цитохромов, названных так из-за того, что они были обнаружены среди самых первых пигментов, постоянно присутствующих в клетках.
Помимо двух упомянутых главных классов переносчиков электронов дыхательная цепь содержит дифенолы, которые окисляются до соответствующих хинонов,железосерные белки, в которых ионы, несущие электроны, заключены в оболочке сульфгидрильных групп, связанные с белками ионы меди и, возможно, другие компоненты. Отметим (как тему для дальнейшего обсуждения), что одни из этих молекул выступают непосредственно как электронные носители (гемопротеиды и металлопротеиды), тогда как другие переносят атомы водорода (т. е. электроны в комбинации с протонами).
Внутри каждой дыхательной микросферы эти различные молекулы организованы таким образом, что могут работать как высокоэффективные «сборочные бригады» электронов. Это означает прежде всего, что они построены в виде нисходящих электронных потенциалов, поэтому электроны могут легко падать от одного компонента к другому. Кроме того, они ориентированы друг к другу так, чтобы их активные центры могли легко обмениваться электронами с партнерами по обеим сторонам; для достижения необходимых контактов достаточно только малейших изменений положения, вызванных тепловыми колебаниями и вращениями. И наконец, они должны подходить к соответствующим входным и выходным отверстиям. Как мы увидим, главный вход обеспечивается флавопротеидным ферментом, который переносит электроны от матричной НАДН к верхней части дыхательной цепи. На более низких энергетических уровнях существуют несколько вторичных вводов. Главное выводное отверстие ведет к кислороду через сложный комплекс цитохромов и меди, известный в настоящее время как цитохромоксидазы, но первоначально названный его первооткрывателем, немецким биохимиком Ото Варбургом, дыхательный фермент. Нам это название представляется наиболее подходящим, поскольку большая часть кислорода, потребляемого для дыхания, в биосфере ис-пользуется благодаря данному ферменту.
Для сборки такой электронно-транспортной цепи требуется большое искусство. И все же эти архитектурные ухищрения кажутся почти тривиальными по сравнению с некоторыми другими свойствами дыхательной цепи, так как микросферы являются не только электронными проводниками. Они также проводники энергии, организованные таким образом, чтобы улавливать энергию, излучаемую электронами по мере их падения к кислороду, и тем самым подготовить их к использованию в биологической работе с АТФ. Другими словами, в микросферах содержатся окфос-блоки.
Это вносит два дополнительных условия в их устройство. Во-первых, потенциал носителей должен быть сбалансирован таким образом, чтобы обеспечить необходимое падение электронов. Вспомним: для производства парой электронов энергии, достаточной для поддержания синтеза молекул АТФ, электроны должны упасть вниз с разностью потенциалов как минимум 300 мВ. Во-вторых, электроны, претерпевающие такие падения, должны подчиняться условиям, так или иначе связывающим их поток с синтезом АТФ. Такая же картина наблюдается при прохождении потока воды через гидротурбину, в результате чего вырабатывается электричество.
Первое условие обеспечивается весьма умело и эффективно. На пути движения электронов имеется по крайней мере три окфос-блока или фосфорилирующих участка, объединенных вместе. Это так называемые участки I, II и III, разделенные плат формами, которые мы обозначим как уровни НАДН, Ь — Начнем с рассмотрения уровня с. Он получил название от цитохрома с, своего основного компонента. Среди веществ, способных отдавать электроны в цепь на этом уровне, имеется аскорбиновая кислота, или витамин С—'вещество, содержащееся в свежих фруктах и овощах и пред-отвращающее развитие цинги — обычной болезни мореплавателей в прошлом. (Слово «аскорбиновая» произошло от сочетания греческой приставки «а», означающей «нет», и английского слова зсогЬи! — цинга.) Не ясно, связано ли противоцинготное свойство витамина С непосредственно с его способностью отдавать электроны, хотя и не исключено, что это осуществляется каким-то особым путем. Однако в лабораторных экспериментах аскорбиновая кослота взаимодействует с митохондриями на с-уровне, и это позволило выявить окфос-блок на участке III, когда обнаружилось, что одна молекула АТФ синтезируется для каждой пары электронов, перенесенной с аскорбиновой кислоты на кислород
Подход к участку II осуществляется через Ь — Q-уровень, названный так потому, что в нем находятся одновременно цитохром Ь и кофермент С, или убихинон — электронный носитель хинонового типа. С уровнем Ь — С? связано несколько ФАД-зависимых флавопротеидов: они служат входными отверстиями для электронов, поступающих от определенных метаболических субстратов, таких, как янтарная кислота — промежуточный продукт цикла Кребса и жирные производные ацилкофермента А — активированные формы жирных кислот. Когда пара электронов поступает на этот уровень, она падает вниз через два последовательных окфос-блока. При этом образуются две молекулы АТФ.
Уровень НАДН занят специфическим флавопротеидом, который переносит электроны от НАДН на участок I фосфорилирования. Для каждой электронной пары, поступающей на этот уровень и собираемой кислородом на дне, синтезируется всего три молекулы АТФ. НАД+ сам по себе служит электронным акцептором в бесчисленном ряде реакций. Таким образом, в этот поток направляется большинство катаболических электронов у аэробных организмов.
Эффективность этих митохондриальных трансформаторов поистине удивительна. При участии НАДН, выступающего в роли донора электронов, свыше 85% свободной энергии окисления восстанавливается в виде АТФ: ЗХ 14=42 ккал на пару электрон - эквивалентов из общей суммы 49. При участии ФАДН2 эффективность ' несколько меньше, но все же значительна и составляет 2X14=28 ккал на пару электрон-эквивалентов из 37, или 76%.
В сочетании с высокой эффективностью реакций холодного сгорания общая эффективность процесса достигает 80%. Эту величину легко рассчитать по данным, приведенным в табл. 4. А данные эти просто ошеломляют! С ними не идут в сравнение никакие источники энергии, созданные руками человека. Они отражают удивительное свойство энергетических преобразователей, заключенных в микросферах внутренней мембраны митохондрий.
Механизм работы этих преобразователей занимал умы лучших исследователей более трех десятков лет. По мнению английского ученого Питера Митчелла, родоначальника широко распространенной хемиосмотической теории, все дело в движущей протоны силе. Эта проблема для туристов представляет исключительную трудность, но все же попытаемся к ней приблизиться. Ибо, как нам станет ясно из гл. 10, это один из центральных механизмов жизни, а потому его рассмотрение стоит затраты дополнительных усилий.

Для нас, как и для большинства живых организмов, воздух настолько жизненно необходим, что мы не можем себе представить жизни без него. И тем не менее, как уже отмечалось , жизнь зародилась и длительное время существовала в мире, лишенном кислорода. Только после возникновения механизма фотосинтеза, известного специалистам как фотосистема II (а произошло это, вероятно, около 3 миллиардов лет назад, кислород начал поступать в атмосферу в значительных количествах, и его концентрация медленно поднималась до современного уровня, составляющего 20%.
Этот феномен представлял собой угрозу для жизни и послужил причиной исчезновения многих видов организмов, сходных с современными облигатными анаэробными организмами. Дело в том, что молекулярный кислород способен взаимодействовать различными способами с восстанавливающимися биологическими молекулами; в результате образуются такие высокотоксичные продукты, как супероксидный ион СЬ" и перекись водорода Н2О2. У выживших в этих условиях организмов, кроме тех, что нашли убежище в свободной от кислорода нише, развились защитные ферменты, в частности супероксиддисмутаза и каталаза. А некоторые со временем преуспели настолько, что «приручили» кислород и превратили его в самого верного союзника жизни — этого им удалось достигнуть благодаря приспособлению АТФ-генерирующих окфосблоков к использованию кислорода в качестве конечного акцептора электронов. И теперь их многочисленные потомки заполняют большую часть живого мира.Судя по известным анаэробным бактериям, адаптация к кислороду, повидимому, происходила постепенно. В конечном счете этот процесс увенчался одним из величайших достижений Природы — созданием фосфорилирующей дыхательной цепочки: рядом, который состоит из 15 с лишним электронных носителей. Разность потенциалов между НАДФ и кислородом составляет в целом 1, 070 мВ. Цепочка построена таким образом, что включает до трех последовательных окфос-блоков в ряду. Такого рода систему можно обнаружить в плазматической мембране некоторых современных бактерий, которые, как предполагают, унаследовали ее от древнейших предков, впервые приобретших плазматическую мембрану около миллиарда лет назад. По существу такая же система имеется и на внутренней стороне двух мембран, окружающих митохондрии, — это отдельные, покрытые оболочкой тельца размерами с бактерии, во множестве разбросанные по всей цитоплазме подавляющего большинства эукариотов растительного и животного происхождения; в этих клетках митохондрии выполняют роль главных центров дыхания и восстановления окислительной энергии. Связь между бактериальными и митохондриальными системами (если допустить, что таковая существует, а это вполне вероятно) представляет собой захватывающую гипотезу.
В наиболее популярной версии этой истории «героем» выступает примитивный фагоцит — гипотетическая гигантская прожорливая, как бактерия, клетка, которая считается промежуточной формой между прокариотами и эукариотами. Среди ее ежедневной добычи, во всяком случае так гласит упоминаемая версия, имелись некоторые аэробные бактерии, которые не были захвачены и уничтожены с целью получения пищи. Но эти бактерии в свою очередь пощадили своего захватчика в отличие от многих уцелевших патогенных бактерий. Более того, они установили с ним постоянное, выгодное для обеих сторон симбиотическое сотрудничество. Их потомки дожили до наших дней в виде митохондрий эукариотов. Полностью слившись с клеткой-хозяином, что вполне естественно и должно было произойти более чем за миллиард лет совместной жизни, эти органеллы тем не менее сохранили остатки генетической системы типичного бактериального вида наряду с некоторыми другими рудиментарными свойствами, присущими их предкам. Как мы увидим в следующей главе, хлоропласты растительной клетки скорее всего также произошли из симбиотически приспособленных фотосинтетических бактерий.
Эта теория, известная под названием эндосимбионтной гипотезы, имеет немало доказательств в свою пользу, в том числе некоторые филогенетические древа, созданные на основе молекулярных последовательностей. Однако ученые ничего не берут на веру, особенно когда дело касается восстановления событий далекого прошлого. По мнению некоторых исследователей, митохондрии с таким же успехом могли произойти из внутренних складок плазма-тической мембраны увеличивающейся аэробной бактерии, подобно тому как образовался вакуом (гл. 6), но с другим типом дифференцировки, который привел к разделению фосфорилирующей дыхательной цепи на отдельные везикулы. Можно предположить и ряд других вариантов, в том числе независимое происхождение бактериальных и митохондриальных систем путем конвергентной эволюции.
Скромному гиду не следует брать на себя смелость предлагать аргументы, которые до сих пор вызывают спор среди знатоков. Однако для тех, кто питает романтическую склонность к эндосимбионт-ной гипотезе, не могу не упомянуть о некоторых чертах митохондрий (и хлоропластов), которые свидетельствуют в пользу их происхождения из бактериальных эндосимбионтов.

Полость, ограниченная плотной, внутренней митохондриальной мембраной, заполнена жидкостью, митохондриальным матриксом. Это богатый белками раствор, в основном состоящий из катаболических ферментов, вовлеченных в окислительное расщепление всех основных пищевых продуктов, в том числе аминокислот, которые состэвляют белки, жирных кислот, которые являются основными компонентами липидов, и пировиноградной кислоты, которая, как мы уже знаем, образуется в цитозоле в виде продукта аэробного гликолиза. Все эти пути объединяются в центральном метаболическом водовороте, известном как цикл Кребса. Свое название он получил в честь Ганса Кребса, англо-немецкого биохимика, обнаружившего это явление в конце 1930-х гг.
В этих превращениях участвует пестрая коллекция экзотических молекул; мы не будем пытаться их выявить, отметим только конечные продукты, которые являются очень простыми веществами: это вода, углекислый газ, аммиак или мочевина, неорганический сульфат, т. е. те или почти те вещества, которые образуются при сгорании в печи. Но здесь мы имеем дело с удивительно холодной печью, в которой вещество сгорает, а тепла образуется мало.
Этот парадокс, как вы, возможно, помните из гл. 7, объясняется просто: пищевые продукты не смешиваются с кислородом, они взаимодействуют с водой и в результате отдают атомы водорода или электроны соответствующим акцепторам. Такого рода превращения протекают при температуре клетки; при этом высвобождается небольшое количество энергии. В редких случаях, когда пищевые продукты производят довольно большое количество энергии, они направляются для участия в работе окфос - блоков на субстратном уровне, как, в частности, происходит при гликолизе.
Возьмем, к примеру, глюкозу. На каждую молекулу этого сахара, окисляемого в живой клетке, высвобождается в общей сложности 12 пар электронов:
С6Н|206 + 6Н20 >- 6С02 + 24е~ + 24Н+.
Две из этих пар образуются за счет окислительного гликолиза («ампутированная змея», см. гл. 7):
С6Н|206 ^ 2СН3—СО—СООН + 4е~ + 4Н+.
Другие десять получены при дальнейшем окислении в цикле Кребса из молекул пировиноградной кислоты, образующейся в результате гликолиза:
2СН3—СО—СООН + 6Н20 к
>- 6С02 + 20е~ + 20Н+.
При гликолизе, как мы уже убедились, электроны переносятся на НАД+ через окфос-блок субстратного уровня:
4е~ + 2Н+ + 2НАД+ + 2АДФ + 2Фн >-
>- 2НАДН + 2АТФ + 2Н20.
В цикле Кребса четыре из пяти пар электронов, высвобожденных в результате окисления одной молекулы пировиноградной кислоты, переносятся на НАД+, в одном случае через окфос-блок субстратного уровня. Пятая пара поступает к фла - виновому коферменту, ФАД (см. ниже) Таким образом, для двух молекул пировиноградной кислоты имеем:
20е" + 12Н+ + 8Н АД + + 2ФАД + 2АДФ + 2Фн ->- 8НАДН + 2ФАДН2 + 2АТФ + 2Н20.
Сложив оба процесса, получим:
24е~ + 14Н+ + 10НАД+ + 2ФАД +
+ 4АДФ + 4Фн >- 10НАДН +
+ 2ФАДН2 + 4АТФ + 4НгО.
что для анаэробного окисления глюкозы, которое обычно происходит в живой клетке с участием быстро вступающих в реакцию электронных акцепторов, дает:
СбН12Об + 2Н20 + 10НАД+ + 2ФАД +
+ 4АДФ + 4Фн 6С02 + 10НАДН +
+ 10Н+ + 2ФАДН2 + 4АТФ.
Аэробная часть этого процесса связана с переносом электронов от восстановленных коферментов к кислороду:
10НАДН + 10Н+ + 2ФАДН2 + 602 *
* 10НАД+ + 2ФАД + 12Н20.
Энергетические балансы анаэробных и аэробных частей легко вычислить. Как мы уже видели (гл. 7), «физиологическая» свободная энергия окисления (электронный потенциал) НАДН составляет —49 ккал на пару электрон-эквивалентов, переносимых на кислород. С учетом того, что «физиологический» электронный потенциал ФАДН2 составляет около —37 ккал .на пару электрон-эквивалентов, переносимых на кислород, для аэробной части сумма составит —:564 (10X49 + 2X37) ккал/г-моль окисленной глюкозы.
С другой стороны, согласно калориметрическим измерениям, «физиологическая» свободная энергия окисления глюкозы с кислородом в качестве электронного акцептора равна — 686 ккал/г-моль. В таком случае анаэробный баланс составляет при-мерно — 122 (686—564) ккал/г-моль, из которых 56 (4Х 14) ккал/г-моль получены в результате работы окфос-блока на субстратном уровне, а 66 расходуются на теплоту.
Другими словами (см. табл. 4), когда живая-клетка «сжигает» глюкозу с использованием собственных электронов вместо кислорода, то сохраняется более 90% свободной энергии, которая будет потеряна, если в процессе в роли акцептора участвует кислород. Большая часть этой энергии запасается в виде восстановленных коферментов и меньшая часть — в виде АТФ. По аналогии с гидродинамикой, которую мы про вели в конце гл. 7, это означает, что элект роны, высвобождаемые при биологическом окислении глюкозы, в первую очередь переносятся в энергетически богатые резервуары, расположенные намного выше уровня вода/кислород. В восьми из двенадцати случаев эти переносы осуществляются через небольшие различия в высоте, с малой потерей энергии. В остальных случаях различия в высоте значительные, но падение электронов используется в работе окфос-блоков субстратного уровня, производящих АТФ.
Жирные кислоты и аминокислоты в основном претерпевают такой же вид холодного сгорания, как пальмитиновая и глутаминовая кислоты (см. табл. 4). Их полное окисление сопровождается запасанием свыше 90% свободной энергии, полу-чаемой при сгорании, в энергетически богатых кофакторах.
Зная эти показатели, мы можем лучше понять положение наших древних анаэробных предков. Поскольку НАД, ФАД и другие электроннесущие коферменты находятся в клетке в каталитических количествах, преимущества холодного сгорания проявляют ся только в том случае, если для электронов, запасаемых в этих коферментах, имеется возможность оттока. При брожении проблема решается путем возврата элект-ронов в субстратный поток. При этом процесс протекает, но с очень низким энергетическим выходом. Так, анаэробный гликолиз, как мы убедились, дает только 47 ккал/г-моль использованной глюкозы, или менее 7% энергии, которая может быть получена при полном окислении. Он снабжает клетку только двумя молекулами АТФ, или 28 ккал готовой к использованию энергии.
Другой недостаток брожения заключается в том, что он налагает жесткие стехиометрические ограничения на метаболические пути. Субстрат . отдает ровно столько электронов, сколько поступит обратно в субстратный поток. Однако если электроны, запасаемые в коферментах, выгружаются на экзогенный акцептор, эти ограничения перестают существовать. В таких случаях любой вид окисляемого пищевого продукта можно полностью использовать. Это обеспечивает большую степень гибкости и зачастую лучший энергетический выход, по крайней мере с точки зрения клетки. Однако, с точки зрения мировых запасов энергии, крайне расточительно, если электроны будут выгружаться без возврата энергии.
Еще раз обратимся к примеру с глюкозой. Как мы имели возможность убедиться, фосфорилирование на субстратном уровне обеспечивает анаэробное брожение двумя молекулами АТФ или 28 ккал/г-моль использованной глюкозы. Из табл. 4 видно, что при полном окислении этот выход удваивается. Но какой дорогой ценой! В то время как при брожении высвобождается только 47 ккал из полученных 686, а оставшиеся возвращаются в окружающую среду в виде энергетически богатых молекул молочной кислоты или этанола, при свободном окислении все 686 ккал растрачиваются для ничтожно малого дополнительного выигрыша, составляющего 28 ккал/г-моль использованной глюкозы И если при изобилии с таким расточительством еще можно мириться, то при нехватке пищи оно становится преступным. И все же, возможно, некоторые примитивные аэробные организмы действовали именно таким путем, и у самых развитых эукариотов до сих пор происходят такие расточительные реакции .
Очевидно, единственный путь свести к минимуму непроизводительную затрату энергии окисления — использовать энергию, которая высвобождается при переносе электронов от восстановленных коферментов к конечному акцептору. Но это сопряжено с удачным расположением окфос - блоков на пути движения электронов. В ходе эволюции сформировалось немало приспособлений такого рода, которые «впряглись в одну упряжку» с определенными акцепторами электронов. Наилучшие результаты были достигнуты с кислородом, выступающим в роли конечного акцептора, особенно после того как фосфорилирующая дыхательная цепочка приобрела свою окончательную структуру — такую, которую мы сегодня обнаруживаем в митохондриях и некоторых аэробных бактериях. Клетки, оснащенные такими современными «спасателями» энергии, в состоянии производить до 38 молекул АТФ из одной - единственной молекулы глюкозы, восстанавливая около 80% всей свободной энергии, высвобождаемой в результате окислительного процесса в готовой к усвоению и использованию форме.

Внутренняя мембрана митохондрий не-проницаема для протонов: сквозь нее не могут проникнуть ионы водорода. А значит, она непроницаема и для гидроксильных ионов, ОН~, которые в противном случае могли бы выступать в качестве носителей ионов Н+, забирая их с собой в виде Н2О и возвращая в виде ОН-. На самом же деле мембрана полностью непроницаема для ионов: ни один ион, будь он отрицательно или положительно заряжен, не может проникнуть сквозь нее в ощутимых количествах путем пассивной диффузии. Все распределение ионов между митохондриями и окружающим цитозолем четко регулируется с помощью специальных во-рот или насосов.
Имеется такой насос, вернее, два типа насосов, и для протонов. Оба предназначены для того, чтобы насильственно перекачивать протоны из митохондрий при условии снабжения энергией. Оба они обратимы, иными словами, могут вырабатывать энергию за счет внутреннего потока протонов. Но их энергетическое снабжение различно: один насос работает за счет электронов, другой — за счет АТФ. Короче говоря, секрет окфоса заключается в том, что поток электронов и синтез АТФ связаны между собой протондвижущей силой.Рассмотрим сначала насос, работающий за счет АТФ. При расщеплении одной молекулы АТФ на АДФ и неорганический фосфат насос выводит п протонов из тела митохондрии. Он может продолжать работать таким образом до тех пор, пока способен превосходить потенциал протонов образующийся снаружи. Когда же этот потенциал становится равным мощности насоса, последний перестает работать, точно так же, как это происходит с электрическим насосом, который способен накачивать воду только на определенный уровень в зависимости от мощности электродвигателя. Мощность насоса, работающего под действием' АТФ, нам известна: она составляет примерно 14 ккал/г-моль расщепляющейся молекулы АТФ. Поэтому максимальный уровень, на который он может поднять протоны, равен приблизительно 14/я ккал/протон-эквивалент.
По такому же принципу работает и электрон-управляемый насос, если не считать того, что он снабжается энергией, высвобождаемой парой электронов, падающих вниз через разность потенциалов. Если эта разность составляет 300 мВ, то получаемая энергия будет равняться 14 ккал/пара электрон-эквивалент. Такой насос, как и АТФ-управляемый насос, перестанет работать, когда потенциал протонов достигнет 14/п ккал/протон-эквивалент, где п — количество протонов, которое насос перемещает на каждую пару падающих электронов. Оказывается, что значение п для двух типов насосов одинаково; в противном случае сопряженная система, описанная здесь, не смогла бы работать.
Если теперь нам известно, что два насоса работают совместно против одного и того же потенциала протонов и один из них оказывается чуть сильнее другого, то более мощный насос поднимет потенциал протонов выше предельного уровня более слабого насоса, который, если он обратим, начнет работать в обратном направлении. То же происходит с двумя электрическими насосами, перекачивающими воду вверх в один и тот же резервуар: если один из них сильнее, он поднимет воду на уровень, достаточный для того, чтобы направить поток обратно через более слабый насос и заставить его работать в качестве генератора. В обратимой системе такого типа количество электричества, вырабатываемого вторым насосом, будет равно количеству электричества, потребляемого первым насосом, за исключением ничтожно малых потерь из-за несовершенства системы. Таким образом электрическая энергия передается с помощью гидравлического преобразователя.Аналогичная ситуация наблюдается в митохондриальной мембране, только уже с другими видами насосов и энергии. Чаще всего более мощным из двух митохондриальных насосов оказывается тот, который приводится в действие электронами, ибо он все время снабжается топливом в процессе метаболизма, тогда как АТФ постоянно потребляется для выполнения различных видов работы в клетке. Вот почему АТФ-управляемые насосы работают в обратном направлении, создавая АТФ с помощью протондвижущей силы, которая снабжается потоком электронов.
Обычно эта система не работает в обратном направлении, так как для этого не существует отдельного источника АТФ Но может случиться, что один из электрон управляемых насосов окажется более мощным, чем другие. Как мы помним, в дыхательной цепи имеются три окфос-блока, каждый из которых связан с разными носителями электронов, а следовательно, с разными насосами протонов. Самый мощный из них тот, что находится на участке III. Его разность потенциалов близка к 500 мВ, поэтому он в основном необратим, тогда как насосы на участках I и II легко обратимы; их разность потенциалов около 300 мВ. Благодаря дополнительному падению до участка III электроны, поступающие в систему на уровнях с или Ь — Пытаясь представить себе эту систему, вы должны понять, что митохондриальные протонные насосы не секретируют просто кислоту, как это делает, например, протонный насос слизистой, выстилающей желудок. Дело в том, что вытесняемые протоны не сопровождаются отрицательно заряженными ионами и не обмениваются на другие положительно заряженные ионы. Как только протоны выталкиваются наружу, нарушается электрический баланс за счет потери положительных зарядов внутри митохондрий, а по всей митохондриальной мембране образуется электрический потенциал, положительный снаружи. По мере увеличения потенциала становится все труднее выталкивать протоны наружу против этого потенциала — вспомним, что, согласно закону Кулона, одноименные заряды отталкиваются друг от друга. В конце концов насос не выдержит перегрузки и остановится, когда работа, необходимая для проталкивания дополнительного положительного заряда против электрического потенциала, сравняется с мощностью насоса. Другими словами, протонный потенциал в этой системе выражается в основном в виде разности электрического потенциала через мембрану. Существует небольшое различие в кислотности между внутренней и внешней частями митохондрий, но оно несущественно.
Мы можем рассчитать мембранный потенциал митохондрии, зная, что мошность насоса составляет 14/п ккал/протон эквивалент (58 600/п Дж/протон-эквивалент) или
58 600 96 500 х га ~ ' / •
По Митчеллу, п — 2; в таком случае потенциал мембраны равен 300 мВ. Но не все ученые разделяют точку зрения Митчелла. Некоторые утверждают, что п — 3 или 4; в этих случаях потенциал будет составлять 200 или 150 мВ соответственно. Другие считают, что величина мембранного потенциала еще ниже, и не потому, что они, не согласны со стехиометрией Митчелла, а потому, что, по их мнению, протонный потенциал частично проявляется в конформационных изменениях мембраны. К сожалению, у нас нет необходимого вольтметра, позволяющего решить этот вопрос. Да и зрение наше не настолько острое, чтобы можно было обнаружить, изменяются ли очертания и формы молекул при энергизации микросфер.Что же мы знаем о самих насосах? Увы, очень мало. Известно несколько АТФ-управляемых протонных насосов. Помните, один из них находится в мембране эндосом и лизосом? Что же касается молекулярного механизма, связывающего перенос протонов с гидролизом АТФ, то ни для одного из насосов он еще не открыт. Известно только, что митохондриальный АТФ-управляемый протонный насос находится в маленьких узелках, выступающих с внутренней стороны мембраны; их можно выборочно разрушить веществом, называемым олигомицином. Как указывает само название, олигомицин получают из плесени . В нашем путешествии мы встретимся и с другими «мицинами». Они являются поистине бесценными помощниками биохимиков и молекулярных биологов, помогая им расшифровать некоторые наиболее сложные биологические механизмы. Интересно, что все эти вещества в некотором роде представляют собой ответвления от пенициллина. До открытия последнего немногие ученые проявляли интерес к плесени. Но после того, как стало известно, что плесневый грибок производит вещество (вполне понятно названное пенициллином), способное остановить развитие некоторых патогенных микробов, начался широкий поиск других плесневых продуктов, обладающих свойствами антибиотиков. С этой целью по всему миру отбирали сотни тысяч линий плесени и получали большой «урожай» активных веществ. Некоторые из них, например стрептомицин, были использованы в клинике. Но от большинства других пришлось отказаться, так как они оказались крайне токсичными для организма человека. Эти вещества подавляют ряд важных биологических процессов, в частности транскрипцию ДНК, синтез белка или окислительное фосфорилирование. В биохимии нередко о работе какого-либо механизма можно судить по тому, как он блокируется ингибиторами. Вот почему эти вещества, будучи непригодными для лечения людей, оказались бесценными для науки. Этот факт, как, впрочем, многие другие в истории науки, лишний раз свидетельствует о том, сколь непредсказуемы открытия и сколь недальновидны те бюрократы, к сожалению, все чаще встречающиеся в последнее время, которые ограничивают деятельность ученых строго определенными программами.
Возвращаясь к электрон-управляемым протонным насосам, мы должны уяснить для себя их место в молекулярной архитектуре самих микросфер, поскольку их работа зависит от обязательного сопряжения между переносом электронов и выведением протонов. Митчелл высказал простую, но любопытную гипотезу относительно такого сопряжения: он предположил, что электроны поступают в окфос - блоки в в1 ае атомов водорода, поставляемых из митохондрий, а покидают окфос - блоки «обнаженными», сбросив протоны снаружи. Согласно модели Митчелла, микросферы образованы из перемежающихся водород - и электроннесущих сегментов, которые образуют петли в толще мембраны. Если это действительно так, вопрос ясен. Но, спрашивается, какого рода ограничения должна налагать молекулярная анатомия микросфер на поток электронов? Ограничение заключается в том, что электроны проталкиваются по синусоидальному пути, который ведет их попеременно от одной стороны мембраны к другой, причем в одном направлении вместе с протонами, а в другом — без них. На самом деле, механизм гораздо сложнее, чем следует из нашего упрощенного описания; он вклю-чает в себя тонкие физико-химические и конформационные изменения, связанные с прохождением носителей от окисленного состояния к восстановленному. Добавьте все эти требования к перечисленным выше, и перед вами будет весьма сложный, четко работающий механизм. Не забывай-те, что весь он умещается в крошечной «биочастице» толщиной в 0,3-миллионную и шириной в одну миллионную часть дюйма!
Из-за внутренних структурных ограничений митохондриальные окфос-блоки не расходуют энергию зря. Поток электронов и синтез АТФ по необходимости сопряжены; это означает, что скорость потока электронов (а также субстрата и потребления кислорода) автоматически доводится до скорости потребления АТФ. В состоянии покоя используется мало АТФ и, следовательно, потребление пищи и дыхание находятся на низком уровне. Но как только появляется внезапная потребность в АТФ, например у спортсмена, начинающего забег, электронный поток тут же многократно увеличивается, вызывая одновременно пропорциональное увеличение катаболического окисления и потребления кислорода. Этот регуляторный механизм называется дыхательным контролем.
Дыхательный контроль зависит от силы связывания, которая в свою очередь определяется непроницаемостью мембраны для протонов. Любое вещество, способное транспортировать протоны через липидный бислой мембраны (протонный ионофор), тут же вызовет разрушение протонного потенциала и, таким образом, приведет к раскрытию системы. Известны многие такие разъединяющие вещества. Их прототипом служит 2,4-динитрофенол.
Другим способом снятия заряда с мембранного потенциала является внесение в систему положительно заряженного иона, способного проникать через мембрану в митохондрии. Но, для того чтобы это произошло, в мембране должен быть подходящий носитель. В природе существует носитель для ионов кальция, поэтому митохондрии стремятся предохранить свое окружение от ионов кальция. Это важный регуляторный механизм (см. гл. 12). Путь для поступления ионов калия можно создать искусственно, внося валиномицин, плесневый токсин, обладающий свойствами ионофора калия. Заметим, что при этом работа все же производится. Электронный поток поддерживает активный транспорт добавленного катиона внутрь митохондрий в обмен на транспорт протонов наружу.
В заключение необходимо указать, что окфос-блоки субстратного уровня, например такие, какие имеются при гликолизе или в цикле Кребса, работают не за счет протондвижущей силы. Они относятся к чисто химическим преобразователям. Длительное время ученые представляли механизм фосфорилирования на субстратном уровне как связанное с мембраной фосфорилирование на уровне медиаторов, которое имеется в митохондриях, ибо большинство из них искали несуществующие химические посредники.

Термин «митохондрия» восходит к греческому слову mitos, что означает «нить», и chandros — зерно. В нем нашел отражение внешний нитчатый облик митохондрий в некоторых типах клеток. Однако в других клетках митохондрии могут иметь форму прутка, яйца илц шара. Иногда несколько митохондрий образуют причудливые сцепления, которые, как утверждают, могут включать целую митохондриальную популяцию клетки, превращаясь в необычную свернутую спиралью открытую структуру, напоминающую скульптуры Генри Мура. Размеры митохондрий колеблются, но имеют тенденцию к увеличению по мере увеличения ' размеров клетки и составляют 1 мкм и выше. Увеличьте эту «фигуру» в миллион раз, и вы приблизите ее размеры к нашим собственным. В случае удачи, особенно если мы правильно выберем объект исследования (например, в мышечной ткани крыльев синей мясной мухи имеются особенно крупные митохондрии), можно даже втиснуться в них. Однако не следует и думать, что мы сможем проникнуть внутрь целыми и невредимыми. Нам будет необходимо прибегнуть к вивисекции.
Снаружи митохондрия кажется заключенной в тонкую гладкую полупрозрачную оболочку. Через эту внешнюю мембрану просматривается внутренняя — ярко-розовая, испещренная многочисленными глубокими бороздками. Если смотреть изнутри, то структуры, соответствующие этим бороздкам, оказываются гребнями, или кристами (лат. ст/а — гребень), которые образуют ряд непрерывных перегородок с внутренней стороны митохондриального тела. В действительности кристы представляют собой не что иное, как выросты непрерывной, полностью замкнутой внутренней мембраны. Мы можем в этом удостовериться, если прорвем внешнюю мембрану и дадим митохондрии возможность впитать воду, нарушив в некоторой степени осмотический баланс. Она довольно сильно набухнет, но при этом ее внутренняя мембрана останется целой и не развернется. Образование крист (а в некоторых типах клеток они заменены трубчатыми выростами) — это приспособление, позволяющее увеличивать поверхность мембраны без увеличения объема тела. В важности подобного увеличения мы убедимся, когда узнаем, что внутренняя мембрана — истинное сердце силовой установки клетки, ее подлинный генератор энергии; она содержит дыхательную цепь и связанные с ней системы фосфорилирования.
С точки зрения эволюции принято считать, что внутренняя мембрана произошла из плазматической мембраны какого-то предполагаемого древнего бактериального эндосимбионта. Внешняя же мембрана, вероятно, произошла из системы вакуолей древнего предка хозяина-фагоцита. И в самом деле, она обладет некоторым сходством с эндоплазматическим ретикулумом, с которым ее объединяет, например, наличие особого пигмента, цитохрома Ь5.